1、從微觀上說，系統內能是構成系統的所有分子無規則運動動能、分子間相互作用勢能、分子內部以及原子核內部各種形式能量的總和。後面兩項在大多物理過程中不變，因此一般隻需要考慮前兩項，二者的總和就是通常所指的內能。但在涉及電子的激發、電離的物理過程中或發生化學反應時分子內部（不包括原子核內部）的能量將大幅變化，此時內能中必須考慮分子內部的能量。核內部能量僅在核物理過程中才會變化，因此絕大多數情形下，都不需要考慮這一部分的能量。內能的絕對量（主要是其中的核內部能量部分）還不完全清楚，但不影響解決一般問題，對於內能我們常常關心的是其變化量。
2、拋開物質內部的結構細節，從宏觀上說，內能是與系統在絕熱條件下做功量相聯系的，描述系統本身能量的一種狀態函數。內能的宏觀定義式為：ΔU=Wa，其中ΔU為內能的變化量，Wa為絕熱過程外界對系統的做功量。在宏觀定義中，內能是一個相對量。
3、內能是系統的一種狀態函數（簡稱態函數），即內能可以表達為系統的某些狀態參量（例如壓強、體積等）的某種特定的函數，函數的具體形式取決於具體的物質系統（具體地說，取決於物態方程）。當系統處於某一平衡態時，系統的一切狀態參量將取得定值，內能作為這些狀態參量的特定函數也將取得定值（盡管還不清楚它的絕對數值是多少）。
4、對於一定量物質構成的系統，通過做功、熱傳遞與外界交換能量，引起系統狀態變化，而導致內能改變，其間的關系由熱力學第一定律給出。對於不存在宏觀動能變化的系統，則有ΔU=W+Q，其中ΔU為內能的變化量，W為外界對系統的做功量，Q為系統（從外界）的吸熱量，該式稱為熱力學第一定律的常用表達式。內能的概念建立在焦耳等人大量精密的熱功當量實驗的基礎之上。能量和內能概念的建立標志著能量轉化與守恒定律（即熱力學第一定律）的真正確立。
