1、紙層析是以濾紙為惰性支持物。濾紙纖維和水有較強的親和力，能吸收22%左右的水，而且其中6~7%的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結合，在一般條件下較難脫去，而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱，所以一般的紙層析實際上是以濾紙纖維的結合水為固定相，以有機溶劑為流動相，當流動相沿紙經過樣品時，樣品點上的溶質在水和有機相之間不斷進行分配，一部分樣品隨流動相移動，進入無溶質區，此時又重新分配，一部分溶質由流動相進入固定相（水相）。
2、隨著流動相的不斷移動，各種不同的部分按其各自的分配系數不斷進行分配，並沿著流動相移動，從而使物質得到分離和提純。
